Estudio de coloracion basica en especimen de reconocimiento
Bacterias Gram positivas y negativas
El microscopio es una herramienta muy importante en microbiología, pero existen limitaciones a la hora de utilizarlo para observar las células en general y las bacterianas en particular. Dos de las más importantes son la resolución y el contraste. La resolución es una limitación contra la que no podemos hacer mucho, ya que la mayoría de las células bacterianas ya están cerca del límite de resolución de la mayoría de los microscopios ópticos. El contraste, sin embargo, puede mejorarse utilizando un tipo diferente de sistema óptico, como el contraste de fase o un microscopio de contraste de interferencia diferencial, o tiñendo las células (o el fondo) con un tinte cromogénico que no sólo añade contraste, sino que también les da un color.
Hay muchas tinciones y procedimientos de tinción diferentes utilizados en microbiología. Algunos implican una única tinción y unos pocos pasos, mientras que otros utilizan múltiples tinciones y un procedimiento más complicado. Antes de comenzar el procedimiento de tinción, las células tienen que ser montadas (untadas) y fijadas en un portaobjetos de vidrio.
Un frotis bacteriano es simplemente eso: una pequeña cantidad de cultivo extendida en una película muy fina sobre la superficie del portaobjetos. Para evitar que las bacterias se desprendan durante los pasos de tinción, el frotis puede ser “fijado” química o físicamente a la superficie del portaobjetos. La fijación por calor es un método fácil y eficaz, y se realiza pasando el portaobjetos brevemente por la llama de un mechero Bunsen, lo que hace que el material biológico se fije de forma más o menos permanente a la superficie del vidrio.
Bacterias Gram negativas
Los laboratorios de microbiología suelen recibir muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) o de sangre de pacientes con meningitis, neumonía o enfermedad febril inexplicable. Los laboratorios también pueden recibir muestras de líquido articular, líquido pleural u otros sitios estériles de estos pacientes. La identificación presuntiva de N. meningitidis, S. pneumoniae y H. influenzae puede realizarse sobre la base de un examen citológico del LCR, la morfología específica de las colonias en agar sangre y/o agar chocolate, las propiedades de tinción en una tinción de Gram o la detección de antígenos específicos en el LCR mediante una prueba de aglutinación en látex o utilizando una prueba de diagnóstico rápido (RDT). Los métodos para la identificación confirmatoria de N. meningitidis, S. pneumoniae y H. influenzae se presentan en los siguientes capítulos de este manual de laboratorio (Capítulos 7: Identificación y caracterización de N. meningitidis, 8: Identificación y caracterización de S. pneumoniae y 9: Identificación y caracterización de H. influenzae).
El personal que corre el riesgo de exponerse de forma rutinaria a N. meningitidis en forma de aerosol debería considerar seriamente la vacunación. Se puede encontrar información adicional sobre salud y seguridad en el Capítulo 4: Bioseguridad. Si bien las infecciones adquiridas en el laboratorio con S. pneumoniae o H. influenzae no se reportan tan extensamente, pueden ocurrir infecciones fatales con estas bacterias, y la vacunación contra estos organismos puede ser recomendada en algunos laboratorios.
Tinción de hematoxilina y eosina
La mayoría de los tipos de células no tienen mucho pigmento natural y, por lo tanto, son difíciles de ver bajo el microscopio de luz a menos que se tiñan. Se utilizan varios tipos de tinciones para hacer más visibles las células bacterianas. Además, se pueden utilizar técnicas de tinción específicas para determinar las propiedades bioquímicas o estructurales de las células, como el tipo de pared celular y la presencia o ausencia de endosporas. Este tipo de información puede ayudar a los científicos a identificar y clasificar los microorganismos, y puede ser utilizada por los profesionales sanitarios para diagnosticar la causa de una infección bacteriana.
Un tipo de procedimiento de tinción que puede utilizarse es la tinción simple, en la que sólo se utiliza una tinción, y todos los tipos de bacterias aparecen del color de esa tinción cuando se observan al microscopio. Algunas de las tinciones más utilizadas para la tinción simple son el violeta de cristal, la safranina y el azul de metileno. Las tinciones simples pueden utilizarse para determinar la morfología y la disposición de una especie bacteriana, pero no aportan ninguna información adicional. Las bacterias vivas son casi incoloras y no presentan suficiente contraste con el agua en la que están suspendidas para ser claramente visibles. El objetivo de la tinción es aumentar el contraste entre los organismos y el fondo para que se vean más fácilmente en el microscopio óptico. En una tinción simple, un frotis bacteriano se tiñe con una solución de un solo colorante que tiñe todas las células del mismo color sin diferenciar los tipos de células o las estructuras. El colorante único utilizado en nuestro laboratorio es el azul de metileno, una tinción básica. Las tinciones básicas, que tienen una carga positiva, se unen fuertemente a los componentes celulares con carga negativa, como los ácidos nucleicos bacterianos y las paredes celulares.
Tinción de Gram
1. Departamento de Ingeniería Biomédica,2. Instituto del Cáncer Knight,3. OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health & Science University, Portland, OR 97201,4. Thayer School of Engineering, Dartmouth College, Hanover, NH 03755,5. Norris Cotton Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 1 Medical Center Drive, Lebanon, NH 03756.
✉ Autores correspondientes: Scott C. Davis, Ph.D., Thayer School o Engineering, Dartmouth College, Hanover, NH 03755; Email: Scott.C.Davisedu; Teléfono: 603-646-9684 y Summer L. Gibbs, Ph.D., Oregon Health & Science University, Collaborative Life Sciences Building, 2730 SW Moody Ave, Mail Code: CL3SG, Portland, OR 97201; Email: gibbssedu; Phone: 503-494-8940
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Diseño general del estudioLos tres objetivos principales de este estudio fueron:Para cada réplica, se tiñeron los tejidos adiposos tumorales y normales con el protocolo DDSI, lo que dio lugar a un total de 60 pares de tejidos. Se adquirieron imágenes en color y de fluorescencia utilizando un sistema de imagen de campo amplio hecho a medida, capaz de adquirir imágenes co-registradas de la fluorescencia de cada sonda. Tras el procesamiento y el análisis de las imágenes DDSI, se evaluó el rendimiento de cada condición mediante el análisis de la curva ROC a través del área bajo la curva (AUC) para determinar el rendimiento diagnóstico del tumor frente al tejido normal. También se completó la confirmación de Her2-IHC y H&E para cada muestra.
